1、刚加完显色剂时梯度明显：显色液可能是从高浓度向低浓度孔加的。

2、酶浓度太高，导致后显色结果都是高的

3、包被-酶标系统不匹配或者酶标的非特异反应太强，或者酶标仪读数范围不够。

4、样本中有能够催化底物的物质，没洗下来。

5、建议：包被、酶标重新做梯度，先用较低的浓度把梯度摸索好，然后再优化灵敏度，后调出所需的灵敏度、线性范围

6、有条件的话，可以把酶免的蛋白系统移植到板式化学发光上，加完底物三分钟读数。

7、蛋白系统灵敏度够的话，显色十分钟就差不多了。

8、酶是自己标的这种情况的，HRP比例不要太高。