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ELISA实验步骤和注意事项
文章来源:2022世界杯中国(官方网站)   添加时间:2022/12/26 9:17:16 点击率:102

今天我整理了一些关于ELISA实验步骤以及它的注意事项,大家跟着晶美小编一起来看看吧。

实验步骤

一、包被抗原

1. 50mM 的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原,使抗原浓度为10-20 μg/ml,加100 μl/孔到96 孔酶标板,4℃放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后,用PBST 洗涤3 次,每孔加入150 μl 1BSA 37℃封闭1 小时。

3. PBST 洗涤3 次后,每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清,并加入对照样品,37℃孵育2 小时。

4. PBST 洗涤5 次后,加入100μl 稀释后的HRP 标记的二抗,37℃孵育1 小时。

5. PBST 洗涤5 次后,显色剂显色20 min 后,酶标仪上读取A405 吸收值。

二、包被细胞 

1. 96 孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well37℃过夜培养。

2. 第二天用PBS 洗涤培养板2-3 次。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin1:10 稀释), 室温下固定15 min

4. ddH2O 洗涤培养板3 次,并晾干,储藏在2-8℃备用。

5. PBST 洗涤3 次,每孔加入150 μl 1BSA 37℃封闭1 小时。

6. PBST 洗涤3 次后,每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清,并加入对照样品,37℃孵育2 小时。

7. PBST 洗涤5 次后,加入100 μl 稀释后的HRP 标记的二抗,37℃孵育1 小时。

8. PBST 洗涤5 次后,显色剂显色20 min 后,酶标仪上读取A405 吸收值。50mM 的碳酸盐包被缓冲液:0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃,保存,Na2CO3 0.15 , NaHCO3 0.293 ,蒸馏水稀释100ml 

ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)

 0.2M Na2HPO4 2.4ml

 0.1M 柠檬酸2.6ml

ddH2O 5ml

ABTS 5mg

H2O2(30%) 4 ul(用前加入)

 

注意事项

血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。

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